聲光偏轉器（AODF）在高速熒光成像中的關鍵作用：FIRE技術簡介

在上一篇文章中（聲光偏轉器（AODF）在高速細胞分選中的關鍵作用：ICS技術簡介），我們學習了發(fā)表在Science上的“High-Speed fluorescence Image-Enab LED Cell Sorting"，其中通過AODF實現了一種基于高速熒光成像的細胞分選技術。而這份速度是由FIRE高速熒光成像系統(tǒng)帶來的，即使用射頻標記發(fā)射的熒光成像系統(tǒng)。zui初是由來自加州大學洛杉磯分校的Eric D. Diebold, Brandon W. Buckley等四位科學家于2013年發(fā)表于Nature Photonics的“Digitally synthesized beat frequency multiplexing for sub-millisecond fluorescence microscopy"這篇論文中提及。

FIRE技術（fluorescence imaging using radiofrequency-tagged emission）是將一種射頻通信的方法應用于高速熒光顯微鏡，同時結合了PMT的靈敏度和速度優(yōu)勢，并利用頻域信號復用、射頻頻譜數字合成以及數字鎖相放大，實現了千赫茲幀率的熒光成像，解決了emccd或者scmos用于流式細胞術速度不足的問題。而FIRE的核心特征在于樣品上每個單獨點均能夠以不同射頻激發(fā)熒光。在兩束移頻激光之間干涉所產生的拍頻處，數字合成的射頻“標記"了熒光發(fā)射的各個像素點。這和無線通信系統(tǒng)中的頻率多路復用類似，FIRE圖像的一行內的每個像素點都被分配了自己的射頻。單元光電探測器同時檢測多個像素的熒光，并從探測器輸出的頻率分量中重新構建圖像（運用數字域的并行鎖相放大來分辨）。

樣品中每個點能以不同的射頻來激發(fā)熒光的秘訣在于其中的馬赫-曾德爾干涉儀（MZI），并使用聲光器件來執(zhí)行拍頻激發(fā)多路復用。如上圖a所示，MZI一路的光通過聲光偏轉器（AODF）產生頻移（帶寬為100MHz），由射頻頻率梳驅動，相位經過設計以最小化峰值-平均功率比。AODF產生多個偏轉光（+1級衍射光），包含一系列的偏轉角度和頻率偏移。MZI干涉儀第二路光通過聲光移頻器（AOFS），該移頻器由單個射頻頻率驅動，提供本振（LO）光束。使用柱面透鏡來匹配LO光束與射頻梳光束的發(fā)散角。在MZI干涉儀輸出的位置，兩束光通過分束器合并聚焦到樣品的一條水平線上，將頻率偏移映射到空間。

熒光在由干涉儀兩路的差頻所定義的各個拍頻下被激發(fā)。樣品中的熒光發(fā)射由共聚焦配置的PMT檢測，并且通過狹縫來排除平面外的熒光發(fā)射。共振掃描振鏡（RS）在橫向上進行高速掃描，即可以二維成像。考慮到熒光團的有限頻率響應，選擇LO光束的頻移將拍頻激發(fā)頻譜外差到基帶，以最大限度利用調制帶寬。這是必要的，因為AOD通常在升頻的次倍頻通帶上工作，以避免諧波干擾。用于驅動AOD的射頻頻率梳的直接數字合成（DDS）定義了每個像素的激發(fā)，而這是通過特定的射頻和相位決定的，從而導致射頻頻率梳與檢測信號之間的相位相干性。而這種相位相干性可以使用相敏數字鎖相放大器的并行陣列使得圖像多路分解，這可以在Matlab中實現。FIRE的并行讀出將導致最大像素速率等于AODF的帶寬。

圖2顯示了FIRE顯微鏡的典型輸出。檢測到的時域信號(圖2a)是來自一排像素的射頻標記發(fā)射的傅里葉疊加。使用短時傅里葉變換計算的時間分辨頻譜(圖2b)揭示了樣本在水平行內位置相關的頻率成分。而樣本的垂直位置是從2.2KHz共振掃描鏡的參考輸出中恢復出來的，zui終形成了二維的圖像（圖2c）。

在這里AOD有三項指標至關重要，可分辨點數（掃描角度），功率平坦化，掃描速度。AOD的帶寬越大，自然掃描的角度也越大，可分辨的點數也越多。掃描時間意味著不同頻率間切換的時間，自然也和成像的速度息息相關。而功率平坦化是AOD晶體和驅動器共同優(yōu)化的結果，為了在掃描的帶寬內獲得近似的衍射效率，不會使得掃描獲得的線性激光陣列中間亮兩邊暗，提供均勻的激發(fā)光。

G&H聲光偏轉器（AOD）可以提供適用于不同波長的型號，在不超過幾度的范圍內，分辨出成百上千個點，掃描時間可以快至幾微秒。G&H為AOD提供光束的精確空間控制，無論是執(zhí)行1D或2D掃描還是執(zhí)行固定角度的光束偏轉。我們的聲光偏轉器可在整個掃描角度上提供高度均勻的衍射效率，并為材料處理和數字成像等掃描應用提供一致的功率通過量。

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